| 19. |
Аннотация |
В мире продолжается ускоренное развитие репортерных систем на основе люминесцентных белков, проводятся исследования в молекулярной генетике, биотехнологии и медицинских исследованиях, как для изучения регуляции генов, так и для исследования различных веществ и сложных смесей с помощью lux-биосенсоров. В продолжение Проекта 2022 планируется с использованием разработанных биосенсоров из набора BEsc провести исследования воды, донных отложений и амфипод ряда водоемов России с целью осуществления экологического мониторинга
и определения механизма загрязнения оз. Байкал и арктических морей алкилирующими соединениями. Наличие разработанных в рамках проекта конструкций LuxAB-Frp для экспрессии генов бактериальной люциферазы, направленной в митохондриальный матрикс, межмембранное пространство митохондрий и цитоплазму, позволит провести исследования механизма воздействия препаратов на основе трифенилфосфония на пул восстановительных эквивалентов и макроэргических соединений в эукариотических клетках. Планируется сконструировать стабильные линии клеток млекопитающих с люциферазами LuxAB-Frp и Luc для токсикологических исследований новых химических соединений и для тестирования эффективности генотерапевтических препаратов, влияющих на окислительный потенциал митохондрий. В рамках исследований, направленных на поиск и оптимизацию репортерных генов, планируется клонировать luxAB-гены из Vibrio vulnificus RK27 (аральский изолят), исследовать термостабильность люциферазы и определить скорость оборота фермента. Недавно нами было показано, что люминесценция клеток E. coli, экспрессирующих
lux-оперон бактерий рода Photorhabdus, усиливается при повышении температуры. В связи с этим, в рамках продления данного проекта предполагается заменить биосенсор в составе BEsc, подобрав конструкцию с постоянной светимостью, и исследовать промотор lux-оперона бактерий рода Photorhabdus на предмет возможного его использования в биосенсорах на тепловой шок. Ранее в проекте 2022 нами проводились структурные исследования Lux-белков P. luminescens и были получены кристаллы отдельных белков LuxAB и LuxC P. luminescens. Предполагается дальнейшая характеризация полученных кристаллов методом рентгеновской дифракции. Хотя структуру белка LuxR1 получить не удалось, были подробно охарактеризованы все три белка: LuxR Aliivibrio fischeri, LuxR1 и LuxR2 A. logei, ― с точки зрения термостабильности и специфичности к различным аутоиндукторам. Выявленные свойства LuxR2 в клетках E. coli уже были использованы для создания уникальной экспрессионной системы с возможностью регуляции концентрацией аутоиндуктора и выключением/включением сменой температуры культивации. В рамках данного проекта будет проверена
работоспособность LuxR2 и будет оценена его термостабильность и чувствительность к аутоиндуктору в клетках Bacillus subtilis, что актуально для развития экспрессионных систем на основе quorum sensing регуляции. Будет проведен поиск новых люминесцирующих бактерий и популяционные исследования люминесцирующей микрофлоры во внутренних водоёмах (Каспийское море — летний период, Аральское — зимний) и в почве (Подмосковье, Северный Кавказ, Краснодарский край). В 2023-2024 годах мы впервые сообщили о массовом обнаружении в воде и рыбе Аральского моря светящихся бактерий, принадлежащих видам V. vulnificus и Vibrio cholerae. Можно предположить, что в Аральском море присутствуют сезонные колебания видового состава люминесцентной микрофлоры, как это было показано ранее в акваториях Охотского и Берингова морей. Выполнение работ проекта 2025 позволит развить биолюминесцентные сигнальные системы на основе клеток млекопитающих, вывести их на новый уровень, позволяющий определять токсикологию новых химических соединений и эффективность генотерапевтических препаратов. Также планируется улучшить бактериальный набор lux-биосенсоров BEsc и продолжить работы по оптимизации репортерных генов, основанных на бактериальных люциферазах. |